Real-time PCR 또는 qPCR (quantitative PCR)은 DNA 증폭 반응이 진행되는 동안 형광 신호를 이용해 실시간으로 반응을 감지하여 정량적인 유전자 분석을 수행하는 기술. 

목적: 특정 DNA 또는 RNA 양의 정량적 분석 

기반 원리: 일반 PCR + 형광 기반 탐지 

RNA 분석 시: RT-qPCR (Reverse Transcription qPCR)

원리 (Principle)

① 초기 Denaturation DNA 이중나선 분리 (95°C) 

② Annealing 프라이머가 목표 DNA에 결합 (50~65°C) 

③ Extension Taq polymerase가 DNA 복제 (72°C) 

④ 형광 측정 증폭된 DNA에 비례하여 형광 증가 실시간 감지

→ 매 사이클마다 형광을 측정하여 증폭량을 추적 → Threshold Cycle (Ct값)을 기준으로 정량 계산

형광 탐지 방식 (Fluorescence Detection Methods)

Non-specific 

Dye 이중가닥 DNA에 결합해 형광 방출

SYBR Green 

Probe-based

특정 서열에 결합하는 형광 프로브 사용

TaqMan, Molecular Beacon, Scorpion 

Melt Curve

증폭 후 melting temp를 분석

특이성 검증용

주요 구성 요소 (Components)

Template DNA/RNA

증폭 대상 유전물질 

프라이머 (Primer)

특정 타겟을 지정해 증폭 유도 

DNA Polymerase

Taq, HotStart Taq, High Fidelity 

dNTP

뉴클레오타이드 공급원 

Buffer & MgCl₂

효소 활성 조절 환경 

형광물질

SYBR Green, FAM, VIC, ROX 등 

기기 (Thermal Cycler + Detector)

온도조절 및 실시간 형광 감지

Real-time PCR 장비 구조 (Instrument Configuration)

[온도조절 블록] + [광원 (LED, Halogen)] → [필터] → [형광 검출기 (PMT or CCD)] → [소프트웨어 분석]

Thermal Cycler

정밀한 온도제어로 PCR 수행 

Optical Unit

다중 채널 형광 감지 (FAM, HEX, ROX 등) 

Software

Ct 분석, melt curve, 표준곡선 분석 

Block Type

96/384 well, Rotor 방식 등 다양

Real-time PCR 분석 방식

상대 정량법 (ΔΔCt method)

기준 유전자 대비 상대적 발현 분석 

절대 정량법

표준곡선을 기반으로 copy number 계산 

Melt Curve Analysis

증폭산물 특이성 평가 

Multiplex qPCR

다중 프로브로 여러 타겟 동시 분석

Real-time PCR의 활용 분야

감염병 진단

코로나19, 인플루엔자, 결핵 등 병원체 탐지 

유전자 발현 분석

특정 유전자 mRNA 정량 (RT-qPCR) 

GMO 검사

유전자 조작 식품 검출 

암 진단 및 예후

Oncogene, Fusion Gene 분석 

유전질환 분석

SNP, CNV 검출 

환경/식품 검사

병원균 검출 (Salmonella, Listeria) 

약물 반응 예측

유전적 바이오마커 발굴

실험 설계 시 주의사항

프라이머 특이성 확보 (GC %, Tm 유사성) 

No Template Control(NTC), Negative Control 포함

Reference gene(내인성 유전자) 적절 선정 (GAPDH, β-actin 등)

Melt Curve 분석으로 비특이적 증폭 여부 확인

ROX 보정, 이중 Probe 간 간섭 방지

법규 및 인증 기준

의료진단기기

FDA EUA, CE-IVD, MFDS 허가 필요 

연구용

RUO 제품으로 제한적 사용 

GLP/GMP 환경

장비 IQ/OQ/PQ 문서화 필요 

데이터 관리

21 CFR Part 11 대응 소프트웨어 필요

최신 기술 트렌드

✅ Digital PCR (dPCR): 절대 정량 정밀도 증가 

✅ One-Step qRT-PCR: 전사 + 증폭 통합 

✅ Multiplexing: FAM/VIC/Cy5 동시 분석

✅ Portable qPCR: 이동형 진단기기 확대

✅ AI 기반 프라이머 설계 자동화

✅ LAMP 연계: 등온 증폭의 qPCR 대체 가능성 검토 중

요약 정리

핵심 기능

DNA 증폭과 형광 신호를 실시간 추적 

분석 능력

정량 분석, 고감도, 특이성 확보 

분석 방식

SYBR, TaqMan, Multiplex 등 

대표 장비

Applied Biosystems, Bio-Rad, Roche 등 

응용 분야

진단, 발현분석, 식품검사, 바이오마커 검출 등